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pbst配制加多少吐温20

来源:1000字 时间:2018-09-06 08:30:04 点击: 推荐访问:

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pbst配制加多少吐温20篇一

ELISA操作规范

ELISA操作规范

试剂配制

1.PBS:磷酸二氢钾(KH2PO4)0.2g,磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)2.9g,氯化钠(NaCl)8.0g,氯化钾(KCl)0.2g,加蒸馏水定容至1000mL。

2.洗液:PBST,PBS中加入吐温-20至浓度为0.05%(V/V)。

3.包被液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液,pH9.6):Na2CO3 0.159g,NaHCO3 0.294g,加蒸馏水定容至100mL。

4.封阻液:加包被液或者上述PBS溶液配置1%明胶,微波加热融化,待至未

完全冷却时使用(牛奶组用)。

包被液配置5%的脱脂乳溶液(非牛奶组用)。

5.底物缓冲液:

A液(0.1mol/L柠檬酸水溶液):柠檬酸(C6H8O7.H2O)2.101g,加蒸馏水定容至100mL。

B液(0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液):Na2HPO.12H2O 7.160g,加蒸馏水定容至100mL。

用前将A液、B液、超纯水按3.645:3.855:7.500的体积比混合,用该混合液配制0.4mg/mL OPD溶液,然后加入H2O2使其在OPD溶液中的终浓度为1μL/mL(按加入H2O2μL数=OPD毫克数计算即可)。

6.终止液:2mol/L H2SO4。

方正滴定

1. 用包被液将抗原稀释为0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16μg/ mL,每个稀释度一行。二抗作1∶3000、1∶5000、1:8000,1∶10000、1∶20000,每一稀释度一列,抗血清为1∶200稀释度的第2次免疫后血清(以上各值仅作参考,可根据实际实验情况进行调整)。

2.包被:包被缓冲液稀释抗原至上述设定浓度后加到96孔酶标板上,每孔100μL,4℃过夜。

3.洗涤:用PBST洗涤三次,每次 5min,扣干。

4.封阻:用含1%明胶(脱脂乳)封阻,每孔250μL,37℃保温保湿1h,PBST洗涤三次。

5.一抗:将稀释后的抗血清加到板孔中,100μL/孔,同时设阴性(免疫前血清)和空白对照,37℃孵育lh,PBST洗涤三次。

6.二抗:加入稀释后的HRP标记的羊抗兔IgG,100μl/孔,37℃孵育lh,PBST洗涤三次。

7.显色:每孔加入100μl新鲜配制的显色液,37℃避光反应15min。

8.每孔加入50μL2mol/L H2SO4终止反应。

9.490nm处比色。

10.效价计算:以P/N>2,且P>0.2时抗血清的最大稀释倍数为抗血清效价,其中P为阳性血清的OD490,N为阴性血清的OD490。

间接ELISA

l.包被:包被缓冲液稀释抗原至某浓度(此浓度采用方正滴定结果)加到96孔酶标板上,每孔100μL,4℃放置过夜。

2.洗涤:用PBST洗涤三次,每次 5min,扣干。

3.封阻:用1%明胶溶液(脱脂乳)封阻,每孔250μl,37℃保温保湿1h,PBST洗涤三次。

4.一抗:将不同稀释度的抗血清加到板孔中,100μL/孔,同时设阴性(免疫前血清)和空白对照,37℃孵育lh,涤PBST洗三次(从此开始需严格注意拍板时勤换纸,不可在已拍过的位置继续扣板以避免交叉污染)。

5.二抗:某稀释度(此稀释度采用方正滴定结果)稀释HRP标记的羊抗兔IgG,100μL/孔,37℃孵育lh,PBST洗涤三次。

6.显色:每孔加入100μL现配制的显色液,37℃避光反应15min。

7.每孔加入50μL 2mol/L H2SO4终止反应。

8.490nm处比色。

9.效价计算:以P/N>2,且P>0.2时抗血清的最大稀释倍数为抗血清效价,其中P为阳性血清的OD490,N为阴性血清的OD490。

2010.10

pbst配制加多少吐温20篇二

原位杂交步骤-自己整理的1

荧光原位杂交

试剂及其配制方法(以下试剂均需用RNase-free水配制):

1×PBS:NaCl 8g∕L、KCl 0.2 g∕L、Na2HPO4 1.44 g∕L、 KH2PO4 0.24 g∕L,溶于DEPC处理的去离子水中,用pH计测其pH,再用NaOH调其pH为7.4;

PBST:PBS加0.1%吐温-20;

LiCI:配4M LiCI 100ml需要LiCI.H20 25.6g,配好后加入千分之一的DEPC,37℃,12h放置,高温灭菌。 4%多聚甲醛(4%PFA):

准确称取40g多聚甲醛,溶于1000ml的1×PBS中,避光于摇床(37℃,160r∕m)上,待其全部溶解后,用棕色瓶分装成小体积包装,保存于-20℃。(注:本方法与其他一些文献用NaOH和HCl先后调节pH而促其溶解的方法略有不同,因是考虑到pH的稳定性;另外之所以采用上述方法使多聚甲醛缓慢溶解而没有采用文献中提及的用NaOH调节其pH至10促其溶解后再用HCl调节pH的原因,除了用一般的pH试纸测量配置好的4%多聚甲醛的pH不够准确外,也因为不能用pH计对其酸碱度进行测量,因为它会损坏pH计)。取以上各成分,溶于DEPC处理过一定量的纯水(或双蒸水)中,测定其pH(放置一段时间待其pH稳定后),据此以HCl或NaOH来调节其pH值至7.4,定容至所要求的体积。

(注:根据实际情况,因DEPC处理过的水其pH会下降,故本实验中实际上是用1mol∕L的NaOH来调节其pH)。 75%甲醇/PBST:将无水甲醇按75%(V/V)比例溶于PBST; 50%甲醇/PBST:将无水甲醇按50%(V/V)比例溶于PBST; 25%甲醇/PBST:将无水甲醇按25%(V/V)比例溶于PBST;

HYB-溶液:50%甲酰胺(V/V)、5×SSC(终浓度)、0.1%吐温-20(终浓度)、RNase-free水(-20℃)pH6.2

HYB+溶液:HYB-溶液、500ug/ml酵母tRNA、50ug/ml(终浓度)肝素,(-20℃);pH6.2

50%甲酰胺/2×SSCT: 50%甲酰胺(V/V),2×SSCT(终浓度); 2×SSCT:2×SSCT(终浓度),0.1%吐温-20;

MAB马来酸缓冲液(Maleic acid buffer):100mM maleic acid,150mM NaCl,pH 7.5(20℃),溶于双蒸水,用浓缩或固体的NaOH调节pH为7.5,并过滤除菌(sterile)

MABT:MAB,使用前加入0.1%吐温-20;

10×Blocking reagent(阻断剂):将阻断试剂(Blocking reagent)溶于马来酸缓冲液中,摇晃并在加热器或微波炉上加热,使其终浓度为10%(w/v);此储存液(原液)需高温除菌?(is autoclaved)并分装后保存于-20℃。

封闭缓冲液(blocking buffer):10%羊血清、2%阻断剂(终浓度),两者溶于MABT;三者MABT:羊血清:10%阻断剂=7:1:2;也有用:1×PBT,2% sheep serum (vol/vol),2 mg/ml BSA)

蛋白酶K储液:10mg/ml;将蛋白酶K按10mg/ml溶于PBT中,分装成100ul的小包装,保存于-20℃。使用浓度为10ug/ml。(注:PBS不需要除酶,因为蛋白酶K可以降解RNase)

抗地高辛荧光素偶联的抗体(Anti-digoxigenin-fluorescein,Fab fragments)保存及使用方法:

1、 激发最大波长(Excitation max):494nm;发射最大波长(Emission

:523nm max)

抗体冷冻干粉末,用1ml双蒸水进行溶解,其终浓度为200ug/ml,即200ng/ul。注意事项:此保存液应该在使用前不久进行稀释,(Note: The stock solution should be diluted shortly before use);

2、 以上保存液在2-8℃避光条件下,可以保存2个月。保存液应

避免反复冻融,分装后,保存于-20℃

3、 推荐使用含0.5%BSA(w/v)的PBS(pH7.4)对以上抗体保存

液进行稀释;

4、 此抗体可以用来对地高辛标记的复合物进行检测,注意事项:

在使用抗体之前,10000rpm离心5min,且在液面吸取需要的体积。

探针的制备过程:

1、 设计上下游引物,加酶切位点(HindⅢ、EcoRⅠ)和保护性碱

基(3个保护性碱基),用来扩增目的基因片段,回收目的基因片段,然后用HindⅢ和EcoRⅠ进行双酶切。

2、 用限制性内切酶(HindⅢ、EcoRⅠ)对载体pSPT18(约1ug

的量)进行双酶切,琼脂糖凝胶电泳并回收酶切后的片段,溶于适量无菌水中。

3、 将pSPT18酶切回收后的片段与相应酶切的基因片段,按摩尔

比例1:10左右进行混合,加入连接酶,16℃,连接过夜。

4、 将以上的重组载体进行转化,选择具有氨苄青霉素抗性的培养

{pbst配制加多少吐温20}.

基,37℃,培养13-15h,保存于4℃冰箱,再进行挑菌,接种于含1‰氨苄青霉素的LB液体培养基中,37℃,180r/min条件下,摇菌过夜。

5、 次日,用特异性引物做菌落PCR,确定插入目的基因片段重组

成功的克隆,保存菌种,其余进行测序验证。

6、 选择测序验证成功的相应菌液,进行扩大培养,回收重组质粒。

7、 对重组质粒分别进行单酶切(HindⅢ、EcoRⅠ),使其线性化,

并回收线性化的质粒DNA,以用于体外转录。(如何回收较好?

1、Purification of linear DNA can be

by achieved ethanol byphenol/chloroform

precipitation.2、) extraction followed

8、 选择插入片段5'端酶切位点的酶(合成反义RNA)或3'端酶切

点的酶(合成正义RNA)。对于本实验来说,用RNA聚合酶T7,对HindⅢ酶切的模板DNA进行体外转录,以产生可以检测CXCR7基因mRNA的反义RNA探针;用RNA聚合酶SP6,对EcoRⅠ酶切的模板DNA进行体外转录,产生用于阴性对照的正义RNA探针。反应体系为20ul,所加模板DNA为1ug左右,10× NTP labeling mixture 2ul、 10×Transcription buffer 2ul、 Protector RNase inhibitor 1ul、 RNA Polymerase SP6 or RNA Polymerase T7 2ul,将以上各个成分轻轻混合后,简单离心,在37℃下孵育2h(延长孵育时间并不能增加标记的RNA的产量;按每1ug模板,可以产生10ug探针RNA)。

9、 向上述反应体系中,加入RNase-free的2ul DNaseⅠ ,37℃

保温15min,以消除模板DNA。

10、 向上述反应液中,加入2ul 0.2M的EDTA (pH 8.0)以终止反

应,RNA转录子可以通过琼脂糖凝胶电泳EB染色来进行分析。

11、 标记好的探针,不能用苯酚\氯仿进行抽提,这样会导致探针

分解。标记好的探针可以在-15--25℃,稳定保存至少一年;要避免反复冻融标记好的探针,可以对其进行小管分装,方便使用。

大飞传给我的:

4) 反应结束后加入30µLRNase free 水和30µL LiCl,离心混匀,

pbst配制加多少吐温20篇三

免疫组化操作步骤

免疫组化操作流程

试剂准备

1. PBS缓冲液(pH7.2~7.4): NaCl 137mmol/L,KCl 2.7mmol/L,Na2HPO4 4.3mmol/L,KH2PO4 1.4mmol/L。

2. 0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(CB,pH6.0,1000ml):柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g。即抗原修复液

3.PBST: PBS+吐温-20(1000:1)洗液可全部运用PBST

4. 3% 甲醇-H2O2溶液:用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。

5. 封片剂:中性树脂+二甲苯。

操作流程

免疫组织化学染色

SP法:

1. 脱蜡、水化:

脱蜡前,应将切片在60℃恒温箱中烘烤60~120分钟,观察石蜡应溶解。

从烤箱拿出切片后尽快置于二甲苯中浸泡30分钟,更换二甲苯后再浸泡30分钟;

无水乙醇中浸泡3分钟;

95%乙醇中浸泡3分钟;

70%乙醇中浸泡3分钟(我用80%);

50%乙醇中浸泡3分钟;

自来水中浸泡3分钟;

梯度脱蜡

2. 抗原修复:(用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片)

高压热修复 高压锅里放少许水,用一量杯或容器(大小能容纳玻片架为宜)装抗原修复液放入高压锅里一起煮沸,再放入玻片架,盖上不锈钢高压锅的盖子,将排气阀门套上,待听到阀门冒气时,即可倒计时2min,之后将玻片杯一起放入凉水中,静置15min,平衡至室温。电磁炉1000W 2min。

3.丢弃抗原修复液,将玻片浸泡在去离子水中(时间不限)可省略

4.用组织笔沿组织边缘画线(可与组织边缘留适当间隙),画完立即放入PBST溶液中浸泡3遍X3min(三个容器,每个容器3min,时间不限制)。

5. 3%H2O2滴加在切片上,室温静置15分钟(3%的H2O2用30%的H2O2加双蒸水稀释10倍,现配现用。目的为阻断内源性过氧化物酶);

6. PBST洗3次各3分钟(过三缸)

7. 滴加正常山羊血清封闭液,室温30分钟。用与一抗不同源的血清即可,本人用Western-blotting的含胎牛血清封闭液。

8. 甩去封闭液(注:不要冲洗),滴加一抗50ul(至少50ul否则易干片),4℃孵育过夜。4℃过夜后需在37℃复温45分钟(未验证:室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。)。

9. PBST洗3次各3分钟;

10. 滴加兔或鼠二抗一滴,先滴辅助剂,再滴二抗,之间用PBST洗三次,每次3min,每次室温各静置15分钟;所用试剂盒为中杉金桥

的超敏二步法免疫组化检测试剂。

11. PBST洗3次各3分钟;

12. DAB显色几秒至几分钟,在显微镜下掌握染色程度;DAB为福州迈新试剂,先配现用。

13. PBST或自来水冲洗10分钟;

14. 苏木精复染20秒,自来水分化;

15.自来水冲洗30分钟;

16. 酒精梯度脱水(酒精浓度从低到高,每缸浸泡数秒即可)、透明、封片、镜检。

pbst配制加多少吐温20篇四

western的具体操作——经典

Western操作步骤

一、试剂准备:

组织匀浆试剂

1.胞浆裂解液 100ml 4℃ (200ml){pbst配制加多少吐温20}.

10mM HEPES PH7.9 238.4mg (476.8mg)

10mM KCL 74.5 mg (149mg)

0.1mM EGTA(380.35) 3.8 mg (7.6mg)

0.1mM EDTA(292.2) 2.9 mg (临时加,0.5M EDTA 19.8µl) (39.6µl)

0.5mM DTT 7.7 mg (临时加,1M DTT 49.8µl) (99.6µl)

0.2mM PMSF(有毒) 3.4 mg (临时加,100mM PMSF 195.4µl) (390.8µl)

苯甲基磺酰氟(胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶)

配好后KOH或 NaOH定至PH7.9

(配 1M DTT 1ml, 154.25mg粉剂加双蒸水至1ml)

(配100mM PMSF 1ml, 17.42mg粉剂加异丙醇至1ml)

(配0.5M EDTA 1.4615g 不含水EDTA-Na 加 8ml水,很难溶,加NaOH调

PH,即易溶,定容至10ml)

电 泳 试 剂

2.30%丙烯酰胺存储液:

14.5g acrylamide丙烯酰胺(有毒,戴口罩,面罩){pbst配制加多少吐温20}.

0.5g 甲叉双丙烯酰胺

加去离子水至50ml 通风橱 搅拌至溶解 4℃ 暗处(棕色瓶) 最长一月

3.2M Tris-HCL,PH8.8 50ml 4℃

12.1 g Tris base

30 ml 双蒸水D.W

慢加浓盐酸至PH8.8 加水至50ml

4.1M Tris-HCL,PH6.8 50ml 4℃

6.05 g Tris base

30 ml D.W

慢加浓盐酸至PH6.8 加水至50ml

5.10%SDS(w/v)10ml 室温

1g SDS(戴口罩,面罩)

加D.W至10ml

6.10%APS 4℃ 密封管内数月(实际隔周新鲜配置)

1g ammomum persulfate 过硫酸铵(戴口罩,面罩)

10ml 去离子水

7.TEMED 避光 4℃

8.10 * 电泳缓冲液 PH8.3 不要用酸或碱调PH 4℃或室温 长期保存

30g (15.15) Tris base

144g (72) glycine甘氨酸

10g (5) SDS

加D.W至1000ml(500ml) 需要稀释成1* 电泳缓冲液使用

9.样品缓冲液 5 * sample buffer 4℃ 保存数周,-20℃数月 8.0ml D.W

1.2ml 1M Tris-HCL,PH6.8

5ml glycerol甘油(丙三醇92.09),剪掉头

4ml 10%SDS

0.8ml 1%bromphenol blue 溴酚蓝

(100mg溴酚蓝 + D.W 至10ml,完全溶解,过滤除去聚合的染料。)

19ml Total volume(1ml ependorf 管分装)

用前加50µl β-巯基乙醇至950µl sample buffer

10.B液:4 * 分离胶缓冲液

37.5ml 2M Tris-HCL,PH8.8

2ml 10%SDS

10.5ml D.W 4℃存数月

11.C液:4 * 堆积胶缓冲液

25ml 1M Tris-HCL,PH6.8

2ml 10%SDS

23ml D.W 4℃存数月

转膜用试剂

12.转移缓冲液 (现用现配)

29.3g 甘氨酸 390mmol/L

5.8g Tris base 48mmol/L

0.375g SDS 0.0375%

200ml 甲醇 20%

加D.W至1L(冷却到4℃),。

13.PBS 1L

8g NaCL

0.2g KCL

3.628g Na2HPO4. 12H2O(1.44g Na2HPO4)

0.24g KH2 PO4

{pbst配制加多少吐温20}.

NaOH(书上是HCL,实际用NaOH)调PH至7.4,加D.W至1L,高压灭菌20分,保存于室温。

PBST 在PBS的基础上加0.05%的吐温-20

二、蛋白样品制备:

组织总蛋白提取:

1.按照1g组织+4ml裂解液的比例,进行组织匀浆。

2. 4℃,10,000转离心10分钟。取上清入Ep管。(12000转30分钟――5.9心脏)

3.根据Bradford比色法定量。

4.调整蛋白质浓度后分装。置于-20℃保存。(短期保存可4℃)

三、配胶: 纱布无水酒精干燥玻璃板、梳子。

1. 配8%胶

10ml 12ml

水 4.8 5.76

30%丙烯酰胺 2.7 3.24

B液 2.5 3

10%APS 50µl 60 µl

TEMED 5µl 10 µl

2. 最后加入10%APS和TEMED,灌胶至距玻璃板顶端1.5厘米。用去离子水覆盖。室温静

置45-60分钟,胶可凝固。凝后吸弃上层水。

3. 配5%积层胶 (1块, 2ml) 3ml 4ml 6 ml 水 1.14ml 1.73ml 2.28ml 3.42 ml

{pbst配制加多少吐温20}.

30%丙烯酰胺 0.34 ml 0.5ml 0.68ml 1.02ml

C液 0.5 ml 0.75ml 1 ml 1.5 ml

10%APS 15µl 22.5µl 50µl 30µl

TEMED 2.5µl 3.75µl 10µl 6µl

4. 灌制积层胶,插梳子,置30-45分钟,拔梳子,冲洗未聚合的丙烯酰胺,把凝胶固定于

电泳装置,上下槽加入1*电泳缓冲液,排出凝胶底部两玻板间的气泡。

四、上样,电泳 每孔的上样量一般为0.5-20µg

样品20µl加入5*上样缓冲液5µl,和预染的蛋白Marker在100℃变性5分钟。甩离,上样。最外侧加等量样品缓冲液,避免边缘效应。上槽加满电泳缓冲液,正负极正确连接,60v,30分钟左右,染料至积层胶底部,改100v,2h左右,至溴酚蓝到达凝胶底部为止。

五、转膜(必须戴手套操作)

1. 在电泳快结束之前裁好转膜用的滤纸,PVDF膜(用圆珠笔做好正面的标记),配制转膜缓冲液(现用现配)。PVDF用100%甲醇浸润10分钟,用水漂洗2次,每次2分钟,再用转膜缓冲液浸泡数分钟。滤纸在转膜缓冲液中浸泡15分钟。

2. 在一个托盘中,倒入转膜缓冲液,平放转膜夹子,在阳极放一张海绵垫片。在海绵垫片上放

置2张用转移缓冲液浸泡过的滤纸,逐张叠放,精确对齐,在上面放PVDF膜,上述每一步都用玻璃移液管作滚筒以挤出所有气泡。

3. 电泳结束后,关闭电源并撤去连接的导线,弃去电泳缓冲液。卸下玻璃板,撬开一面,使凝胶暴露出来。

4. 把凝胶转移到一盘转移缓冲液中略为漂洗一下,(不要将凝胶浸泡在转膜缓冲液中),然后准确平放于PVDF膜上。把凝胶左下角置于PVDF膜的标记角上,戴手套排除所有气泡。切记:为避免发生短路,不要切去凝胶的左下角。

5. 丙烯酰胺凝胶放在PVDF膜上,要保证精确对齐,而且在PVDF膜与聚丙烯酰胺凝胶之间并不留有气泡。(如果先放置凝胶,应放于阴极侧。)

6. 把最后2张滤纸及海绵垫片放在凝胶上方,同样须确保各层精确对齐并不留气泡。 7. 连接电源。胶侧负极,膜侧正极。 300 mA恒流, 转膜1小时。

8. 断开电源并拔下插头,从上到下拆卸转移装置,逐一掀去各层。将凝胶转移至盛有考马斯亮蓝染液的托盘中,进行染色,以便检查蛋白质转移是否完全。

PVDF膜进行封闭。

六、免疫反应

1. 5% 牛奶(PBS配制)室温振摇1小时,然后4℃封闭过夜。封口膜封闭,注意:不要有气泡。

2. 第二天继续摇1小时,PBST洗膜10分钟,3次。

3. 加一抗摇,室温4小时。PBST洗膜3次,每次10分钟。

4. 加二抗室温摇1小时, PBST洗膜10分钟,3次。

七、显色反应

DAB显色:试剂盒

A液40 µl+960 µl双蒸水配成工作液,显色前+40 µl B液,混匀后立即使用。观察显色情况,理想时(一般3-10分钟)用蒸馏水漂洗终止显色反应。

pbst配制加多少吐温20篇五

专业分析完整版{pbst配制加多少吐温20}.

版本只用作参考,各取所需

选择题

1.四分法是针对固体物料中均匀的采样方法

2.气相色谱检测器是一种测量指示载气中各分离组分及其浓度变化的装置,其中最常用的通用性检测器是①热导池检测器(TCD)——对无机物和有机物都有响应②氢火焰离子化检测器——只对有机物有响应,最常用的选择性检测器是:①火焰光度检测器(FPD)——对含P、S有机物响应,②电子捕获检测器(ECD)——反对电负性的物质有响应(S2-,H2-)

3.当用梯度PH缓冲液洗脱时,随PH由低到高,氨基酸洗脱顺序为:

酸性和小分子极性氨基酸,随后是中性和疏水性氨基酸,最后是碱性氨基酸。同种性质的氨基酸R基团疏水性弱者先流出,疏水性强者后流出。

4.蛋白酶测定时,缓冲液的不同

①PH7.5磷酸缓冲液,适用于中性蛋白酶

②PH3.0乳酸缓冲液,适用于酸性蛋白酶

③PH10.5硼酸缓冲溶液,适用于碱性蛋白酶

5.水溶性维生素稳定,常在酸性溶液中进行预处理

脂溶性维生素见光易分解,预处理:维生素→浓缩→溶于适当溶剂

6.色谱中的定量方法(归一化法、内标法)的适用范围:

归一化法:当样品组分都能流出色谱柱,可用此法进行定量计算。

7.等电点和PH的关系以及电泳方向的关系

①PH=PI,两性电解质,不带电,不迁移

②PH<PI

③PH>PI

8、封闭的目的、洗涤的目的?

封闭的目的:使其失去和后续步骤中其他反应试剂结合的能力。

20(PBST),洗涤要彻底,3。

9

0100C以上易变质、破坏或不易除去结合水的

可先将式样与洗净并干燥的海砂混匀,置沸水浴中,搅拌下蒸发水分后,

④对食品中糖果、乳粉、巧克力、脱水蔬菜等中的水分测定可采用化学法—卡尔费休非水滴定法。

10、消除测定过量中随机误差和系统误差的方法:

一、系统误差:①空白实验(试剂、背景的影响)、②对照实验、③仪器校正、④分析结果的校正。

二、随机误差:增加平行测定次数。

11、光谱的分类及具体方法:

光光度发、红外光谱法、原子吸收光谱法)吸收光谱(紫外可见分、磷光光度法)光谱法发射光谱(荧光光度法

散射光谱(拉曼光谱)

填空:

1、了解试剂级别

①优先纯:绿色、精密分析。

②分析纯:红色、一般分析。

③化学纯:蓝色、要求不高的一般分析。

④实验试剂:黄色、要求不高的实验工作。

2凯氏定氮吸收和滴定的颜色变化

硼酸吸收时溶液变为亮绿色,滴定时由亮绿色变为浅紫红色。

3.原子吸收的概念

原子吸收分析是基于从光源发射出的待测元素的特征谱线,被蒸汽中的待测元素的基态原子吸收,根据特征谱线减弱程度,这种方法称为原子吸收分光光度法。{pbst配制加多少吐温20}.

4.气相色谱的分类

气相色谱:气——固色谱,吸附⇌⇌挥发的过程

5.

6,化学发光免疫分析的定义:

发光免疫分析是一种利用物质的发光特性,发光的光子数及与产生辐射的2,5-氨基邻笨二甲酰肼等 7,包被的定义

包被是ELISA而抗原由于其各类的多样

100ml,置37℃、4h,或4℃、

8

抗坏血酸作为还原剂,在加热情况

9.索氏抽提中样品,有机溶剂不干燥会有什么影响?

①试样需干燥,否则有机溶剂不易渗透,使结果偏低

②有机溶剂应无水,否则试样中碳水化合物及无机物易被抽提,使结果偏高

10.索氏抽提两种定量方法:

脂肪含量较低的试样,由于抽提瓶质量与粗脂肪质量差太大,测定结果误差较大,此时可采用称量抽滤前后试样滤纸筒。

11.酶解法测定淀粉的原理

样品经除去可溶性糖类及脂肪后

(C6H10O5)nH淀粉酶低分子糊精+麦芽糖葡萄糖

12.α—淀粉酶活力测定的原理

α—淀粉酶能将淀粉分子链中的α—1,4葡萄糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精,少量麦芽糖和葡萄糖,而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异性反应逐渐变红棕色直至消失,其颜色消失的速度与酶活力有关,故可通过测定反应后的吸光度计算其酶活力。

13.测维生素C终点颜色变化

维生素C(抗坏血酸)在草酸介质中,被染料2,6一二氯靛酚氧化,过量一滴染料由微碱性中退色突变为酸性中红色以示终点。

14.灰分测定时防止发泡就加:

灰化中各灰分未能变白,可将瓷坩埚冷却后加入几滴HNO3或H2O2;灰化时可加几滴无灰植物油,以防止试样膨胀而溢出瓷坩埚。

15.糖化酶测定的原理{pbst配制加多少吐温20}.

糖化酶催化淀粉水解,从淀粉分子非还原性末端开始。分解α萄糖;葡萄糖分子中含有醛基能被次碘酸钠氧化,再硫代硫酸钠标准溶液滴定,计算出酶活力。

16.聚丙烯酰胺等电聚集电泳的定义

17.凯式定氮大步骤

消化:有机含氮物+ H2SO4CO2+SO222NH3+H2SO44)2 蒸馏:(NH4)2SO4+2NaOH4+2NH3

吸收:2NH3 +4H3BO34B42滴定:(NH4)2B4O73BO3

18.

19.铜测定原理

DDTC)生成橙红色络合物,经四氯化

20.

21.

判断题

1, 减少随机误差和系统误差的方法

随机误差:增加平行测定次数

系统误差:①空白实验②对照实验③仪器校正④分析结果的校正

2, 朗伯尔-比尔定律的适用范围 /

AlgIobc只有在稀溶液中,A与C成线性关系条件下使用,随着溶质浓度增大,吸I

光质点间距离缩小,彼此间相互影响和相互作用加强,破坏了吸光度与浓度之间的线性关系。

3, 维生素A性质

维生素ADE均为脂溶性维生素,维CB为水溶性维生素,维A在三氯甲烷中能与三氯化锑形成蓝色物质,可用比色法测定。

4, 竞争法测黄曲霉毒素的原理

抗体预先包被在微孔中,样品提取物和酶标记的黄曲霉毒素混合物一起加到每一个微孔中,待测样品中的游离黄曲霉毒素竞争微孔中有限的抗体结合部位,未结合的酶标记的黄曲霉毒素被水洗掉,结合的酶标记的黄曲霉毒素通过添加一种酶底物而产生有色物质,待测样品中黄曲霉毒素含量越少就会导致更多的酶的结合,从而产生更多的有色物质,待测样品中的黄曲霉毒素通过标准曲线的方法来定量。

5, 干法灰化和湿法消化的定义

灰化:样品经高温燃烧后,其中有机物被氧化分解,以CO2、H2O而无机物则残留下来。

湿法消化:干品与浓H2SO4、浓HNO3加热消化,使有机物分解

6, 氨基酸自动分析仪不仅能用于分离物质,还能用于定量测定。

7, 淀粉酸水解,酶水解各自的优缺点

酸水解优点:简便易行,费用低 酶水解优点:选择性和准确性高 缺点:操作复杂。

简答题

1、凯氏定氮原理(含方程式)、注意事项?

样品与硫酸一同加热消化,在定氮仪中加入强碱消化,生成四硼消化:有机含氮物+H2SO4→CO2↑+SO2+H2O↑+NH3蒸馏:(NH3)2SO4+2NaOH→2H24+NH3

吸收:2NH3+4H3BO3→(NH4)2B4O7滴定:(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O2NH43

2

(1)(2).

(3).

(4).3

吸收池:盛放待测溶液

检测器:检测吸收后的紫外—可见光信号,将光信号转变为电信号。

信号指示系统:将测得的信号以数值形式指示出来。

原子吸收分光光度计:

光源:发射出待测元素的特征谱线。

原子化器:将试样中的待测元素变为气态基态原子。

单射器:将特征谱线跟其他发射线分开。

检测器:将光信号转变为电信号。

4.测灰分时碳化的目的?

pbst配制加多少吐温20篇六

WB实验基本步骤

实验基本步骤

提取细胞蛋白

↓ BCA定量

制备蛋白胶(SDS-PAGE胶)

蛋白样品变性

↓ 电泳 ↓ 转膜 ↓ 封闭 ↓ 一抗 ↓ TBST洗涤

↓ 二抗 ↓ TBST洗涤

↓ 显影 ↓ 结果分析

试剂配制

1.PBS磷酸盐缓冲溶液1L

磷酸二氢钾 0.24g 磷酸氢二钠 1.44g 氯化钠 8g 氯化钾 0.2g

加入500ml纯水,调PH=7.2 定容至1L,高压蒸汽灭菌

2.PBST(PBS+0.05%吐温-20)

500mlPBS+0.25ml吐温-20

3.电转液500ml

Tris 1.5g 甘氨酸 7.2g 400ml水溶解

加入100ml甲醇,置于4℃冰箱预冷

4.电泳液(1X)

10x稀释,50ml10x电泳液+450ml纯水

5.TBS

6.TBST(TBS+0.05%吐温-20)

50mlTBS+450ml纯水+0.25ml吐温-20

7.封闭液

TBST1X+5%奶粉

40ml封闭液=40mlTBST+2g奶粉,40℃预热

WB实验

一、蛋白样品制备

准备:一管细胞,PBS(4℃预冷),PMSF(100mM),移液枪(1000ul,10ul),1.5mlEP管2个,高速冷冻离心机4℃预冷

1.于-20℃冰箱中取出一管细胞样品,吸去培养液

2.加入1ml 4℃预冷的PBS(0.01M pH7.2~7.3)。用移液枪轻轻吹成悬浮液后4℃,8000r离心5min,然后弃去上清。重复以上操作一次,共洗细胞两次以洗去培养液。

3.按1ml裂解液加10 μl PMSF(100 mM),摇匀置于冰上。(PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。) 4.在样品中加入300ul含PMSF的裂解液,吹匀,于冰上裂解30 min,为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。

5.裂解完后,于4℃下12000 rpm离心5 min。

7.将离心后的上清分装转移倒0.5 ml的离心管中放于-20℃保存。

二、 蛋白含量的测定(BCA定量)

准备:96孔板,移液枪(1000ul,10ul,200ul),BCA工作液(A+B),50mlEP管,1xPBS,BSA标准液 1.将96孔板分好区域,若不够分则只做两个重复,(外围一圈的孔最好不用)

2.算好孔数(总的)每孔加200ulBCA工作液(A+B),(A液:B液=50:1,一般配多些,如60孔,A液12000ul,B液240ul)

3.将样品稀释到一定倍数才能定量,(10倍,20倍,30倍),每孔需要20ul样品(2ul样品+18ulPBS,即稀释10倍),做三个重复则需要60ul,一般配80ul

4.配蛋白标准样品,将2mg/ml的蛋白标准溶液稀释至0.5mg/ml,若配200ul 的0.5mg/ml蛋白标准溶液则需要50ul的2mg/ml的蛋白标准溶液和150ul PBS溶液

5.将稀释好的样品加入孔板中(标记的区域),接着标准品按0,1,2,4,8,12,16,20ul加到标号的区域,之后在加标准样品的孔内,将孔内溶液用PBS补足到20ul 6.每孔加200ul配好的工作液,平行加,不能上下加,以减少误差 7.将加好的96孔板放在37℃下孵育30分钟

8.孵育完后,放在酶标仪轻微震荡3-10s,中速,吸光值595nm,进行比色测定,记录标准曲线及样品吸光值数据后,以蛋白含量(ml)为横坐标,吸光值为纵坐标作标准曲线。(R2 >0.98才有用,酶标仪操作:两个箭头图标,1是结果,2是保存)

9.计算蛋白含量(注意定量样品已经稀释了10倍)

序号

标准蛋白量/ul (0.5mg/ml) 背景液(PBS)/ul 标准液浓度mg/ml

1 0 20 0

2 1 19 0.025

蛋白质定量标准曲线加样量 3 2 18 0.05

4 4 16 0.1

5 8 12 0.2

6 12 8 0.3

7 16 4 0.4

8 20 0 0.5

三、SDS-PAGE电泳

1. 配胶(12%,可以提前配好)

准备:玻璃板,梳子,AP(解冻,现拿现用),聚丙烯酰胺(4℃冰箱冷藏) (1)玻璃板验漏5min (2)按表配置分离胶

(3)灌胶,加酒精封压,凝30min(注意不要有气泡)

(4)按表配浓缩胶,倒掉酒精,用吸水纸吸去酒精,灌胶,插梳子(注意不要有气泡),凝30min (5)取胶,用水冲洗一下浓缩胶,加少量水放入一次性手套中4℃冰箱保存备用 2. 样品处理

准备:PBS,移液枪,1.5mlEP管

(1)稀释样品:一般每孔上样5ul,即1mg/ml浓度的样品,测完蛋白含量后,将样品用PBS稀释至1mg/ml(注意loadingbuffer的加入也得算入)

(2)取出上样样品15ul至1.5 ml离心管中,加入6×SDS 上样缓冲液3ul至终浓度为1×。(上样总体积一般不超过15 μl,加样孔的最大限度可加20 μl样品。) (3)将样品在100℃煮5 min震荡使蛋白完全变性(注意仪器操作) 3. 电泳

准备:电泳液500ml(现配),蛋白胶,10ul移液枪(枪头),样品,Marker,冰盒,电泳装置

(1)将SDS-PAGE胶放入电泳槽中,加足够的电泳液。(短玻璃板面向内,长玻璃板面向外。若只跑一块胶,那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。电泳液至少要漫过内测的短玻璃板。注意先检漏。) (2) 上样。用移液枪贴壁吸取样品,将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。(加样太快可使样品冲出加样孔,若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时,进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次,以免交叉污染。)

(3)先设置80V,开始电泳,样品溴酚蓝跑至分离胶后增至120V电压,电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳,进行转膜。(此时准备好电转液)

四、转膜

准备:电转液(现配4℃冰箱冷藏),镊子,滤纸,PVDF膜(0.45um),电转装置,冰盒 注意:拿滤纸和膜时一定要戴手套或用镊子,因为手上的蛋白会污染膜。 1. 在加有转移液的盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫

2. 滤纸浸入电转液中,PVDF膜在甲醇中润湿成半透明,小心将膜放入4℃电转液中平衡至少5min。 3. 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫,用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。(一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。)在垫子上垫三层滤纸(可三张纸先叠在一起在垫于垫子上),一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。

4. 先将玻璃板撬掉才可剥胶,撬的时候动作要轻,要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动,直到撬去玻板。(撬时一定要小心,玻板很易裂。)除去小玻璃板后,将浓缩胶轻轻刮去(浓缩胶影响操作),要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上(做好标记),用手调整使其与滤纸对齐,轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上,要盖满整个胶(膜盖下后不可再移动)并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫,擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行,要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触,接触后会发生短路。(转移液含甲醇,操作时要戴手套,实验室要开门以使空气流通。)

5. 将夹子放入转移槽中(电转移时会产热,浆槽放入冰中),要使夹的黑面对槽的黑面,夹的白面对槽的红面。一般用100mA转移90min。

6. 转完后将膜用1×丽春红染液染5 min(于脱色摇床上摇)。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。将膜晾干备用。(准备封闭液)

六、免疫反应

准备:封闭液,一抗,二抗,TBST

1 . 将膜移至含有封闭液的平皿中,室温下脱色摇床上摇动封闭2h。 2. TBST洗4次。每次5分钟。

3. 将膜按照目的蛋白所处位置剪切并做好标记,加入相对应的一抗,室温孵育2h或者4℃过夜 4. 室温下孵育1~2 h后,用TBST在室温下脱色摇床上洗四次,每次5min

5. 同上方法准备二抗稀释液并与膜接触,室温下孵育1~2 h后,用TBST在室温下脱色摇床上洗4次,每

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